富血小板血漿在骨科領域的應用
日期：2013-08-29
富血小板血漿( plate let rich plasma, PRP) 是自體全血經過梯度離心、分離得到的血小板濃縮物, 血小板含量豐富。當血小板激活時, 能釋放多種生長因子,它們在促進骨細胞和成骨細胞的增殖、生長、分化和組織的形成過程中起著重要的作用[1]。自1998年Marx等[2]首次用PRP復合移植骨修復下頜骨缺損以來，PRP已逐漸應用于口腔、整形、骨科、耳鼻喉科、神經外科等領域的組織修復中。本文現就PRP的分離、制備和其在骨科領域的應用以及存在問題進行綜述, 并對其應用前景作一展望。皖南醫學院弋磯山醫院創傷骨科楊民
1 PRP的分離和制備
PRP是根據血液中各組成成分沉降系數不同，通過密度梯度離心法將PRP從全血中分離出來的PLT濃縮物，但目前尚無統一的制備方法[3]。 不同離心次數、離心力、離心時間以及PLT不同的激活方式所制備的PRP中，PLT數量、各種生長因子濃度、白細胞數量各不相同[4];且各種手術方式以及應用PRP的時間亦產生不同的生物效應，因此產生了對PRP生物效應的分歧[5]。根據不同生理病理需要，制備不同生長因子含量的PRP是未來研究的方向。
PRP的制備方法大體可分為手工制備和全自動制備兩種。手工制備過程較繁瑣，但所需設備簡單，易于開展。全自動制備需要特殊設備，目前常用設備有SmartPReP 系統、Trissee 系統、Platele concentrate collection系統、Curasau 系統等。手工操作分離法與全自動血小板分離機分離法在離心后，血小板數量無明顯差異，雖然全自動血小板分離機操作簡便，自動化程度高，制備得到的PRP血小板純度和濃度均高，但此方法一般用于用血量較多(一般在150ml以上)或需建立靜脈循環通道，目前主要用于血庫血小板的采集以進行成分輸血，因其成本較高，限制了其在臨床的廣泛應用。但無論是何種制作方法，其制備原理均相似，即根據血液中各組分的沉降系數進行分層制備。1次離心后血液可分為3 層，最底層是沉降系數最大的紅細胞，最上層是上清液，交界處有一薄層，即富血小板層。一次離心后棄去上清液或紅細胞層，然后改變離心力再次離心，可分離更多血小板。兩次離心法仍是目前制備PRP的常用方法。劉彩霞等[6]比較了動物模型中不同離心力和離心時間所制備的PRP對牽張成骨的影響，結果顯示應用Landesberg法以兩次離心(每次200 × g、離心10 min)法制作的PRP血小板計數明顯高于全血，為全血的6.17 倍;血小板回收率超過86%，促進新骨生成的作用較明顯。離心力> 250 × g時會導致血小板破壞過多，而一次離心時間< 5 min得到的PRP血小板濃度與全血無明顯差異[7]。Marx[2]等在制作PRP時發現，先進行高速離心，1次離心后界面以下2mm的紅細胞層血小板濃度最高，棄去上清液后再次以低速離心，這樣可更好地提取血小板。但多數學者研究認為，采用改良Appel[8]法，即先以低速離心后吸取全部上清液、交界層下少部分紅細胞置于另一支離心管，然后高速離心，所得的血小板回收率較高。
富血小板血漿的作用機理
PRP的作用是通過生長因子的相互作用和相互調節下完成的, 生長因子分泌后立即黏附至靶細胞膜表面，激活細胞膜受體。這些膜受體再誘導出內在的信號蛋白，激發細胞正常的基因序列表達。因此，PRP釋放的生長因子不進入靶細胞內，不會導致靶細胞的遺傳性能發生改變，僅使正常愈合過程加快。雖所有參與組織修復與重建的細胞因子作用機制仍不明確[3]，但是細胞因子對組織修復與重建的部分作用已經明確，如：PDGF是最早出現在骨折部位的生長因子之一, 可以刺激骨髓基質細胞的有絲分裂,增加成骨細胞的數量; 刺激內皮細胞的生長, 促進受植區的毛細血管的生成; 還可以刺激單核巨噬細胞的趨化。作為一種促進有絲分裂和生物趨化因子, 可以在創傷骨組織中高度表達, 促進成骨細胞的趨化、增殖, 并增加膠原蛋白合成的能力[ 9] ;TGF-β以旁分泌和/或自分泌的方式作用于成纖維細胞、骨髓干細胞、成骨前體細胞和破骨細胞, 刺激成骨前體細胞及成骨細胞的趨化、有絲分裂及膠原纖維的合成, 抑制破骨細胞的形成和骨吸收, 在骨折修復中具有極為重要的作用[ 10] ;IGF促進成骨細胞的增生和遷移作用, 提高成骨細胞活力 ; VEGF可誘導內皮細胞增殖遷移從而促進新生血管形成等[11]。另外，激活的PLT同時釋放大量蛋白質，這些蛋白質對組織再生均有重要意義。凝血酶可以募集周圍組織血管內皮細胞，增強其活力，人體臍靜脈三維培養條件下，凝血酶可刺激成纖維細胞增殖及新生毛細血管形成，同時可誘導負反饋，從而限制新生毛細血管合成[12]。纖維蛋白刺激角化細胞遷移，實現細胞和細胞間的相互作用，對細胞形態恢復具有重要意義[13]。
3 PRP 在骨科領域的應用
3.1 骨缺損修復
骨缺損的修復一直是骨科臨床所面臨的難點之一, 目前對骨缺損修復的方法主要有自體骨移植、同種異體骨移植、生物材料填充、組織工程技術、基因治療等。自體骨移植時雖可以取得滿意的療效,但骨來源有限, 且取骨不僅需要額外的手術操作,還增加患者痛苦, 同時還會引起多種術后并發癥及附加損傷。組織工程學的創立和發展為骨缺損的修復提供了新的思路和方法。復合成骨細胞和/或生長因子的生物材料具有良好的骨誘導性，在修復骨缺損中具有良好的應用前景。但是生長因子大多于體外制備，且多為單一因子，制備復雜，價格昂貴。Assoian [ 14] 首先發現了血漿中提取的PRP中含有多種生長因子, 為骨缺損的修復提供了廣泛的應用前景。Marx[ 2 ]最早應用PRP進行骨缺損修復的臨床研究，其研究結果表明, PRP復合移植骨修復速度比單用移植骨修復速度快1.162倍至2.116倍, PRP組移植骨密度(74.0% ±11% )明顯高于對照組(55.1% ±8% )。Fu jimori等[ 15]將自體骨復合PRP用于兔脛骨缺損, 研究發現PRP不僅加快新骨形成, 同時提高新生骨質量。Kovacs等[16] 在犬下頜骨缺損修復研究中發現通過骨密度評價和組織學評價, 復合PRP的生物材料組均優于單純使用生物材料組, 認為PRP對骨缺損有修復作用。
3.2 脊柱融合方面的應用
PRP的研究為脊柱融合開辟了一條新途徑, 它解決了自體骨來源有限, 異體骨免疫排斥反應, 生物材料無骨誘導活性, 單一生長因子制作復雜、價格昂貴等缺陷, 明顯促進成骨作用, 加速骨愈合能力, 提高脊柱融合率, 促進患者術后病情恢復及生活質量的提高。但目前PRP在脊柱融合方面尚處于研究階段, 相關報道有限。Lowery等[ 17]證實PRP能夠早期促進骨融合, 在臨床上應用于腰椎融合時產生良好的效果。Hee 等[18] 報道，自體髂骨復合生長因子早期骨融合率高于單純自體髂骨植骨，23例應用自體髂骨復合PRP 患者中，術后4 個月及6 個月X 線評價融合率為70% 及96%，而自體髂骨移植患者中分別為36% 及94%，術后24 個月，兩組間無明顯差異，分別為96% 和94%。Castro 等[19]在腰椎間孔入路腰椎椎間植骨融合術研究中發現，復合PRP組融合率低于對照組19%，分析原因可能與腰椎生物力學環境、制備PRP的技術、PLT數量、功能以及生長因子濃度有關。
3.3 半月板關節軟骨損傷與修復
通常，受損的關節軟骨本身只有很弱的再生修復能力[20]，如何對受損的關節軟骨進行修復、恢復關節面完整性、重建關節功能和防止關節退變是再生醫學的研究熱點。動物實驗及臨床應用均表明PRP 具有促進損傷軟骨組織修復的功能。Cugat 等[21]在兔全層軟骨損傷模型中，首次應用局部注射自體PRP，發現軟骨的生物力學行為明顯改善，軟骨細胞增殖，軟骨損傷明顯修復。Kon等[22]最近報道關節內注射PRP治療100例患有慢性膝關節軟骨退行性疾病患者(每次注射PRP 5 ml，21天注射3次為一療程)，注射后注射口無菌包扎并囑患者屈伸膝關節數次，術前和術后應用患者自評總體健康狀況視覺類比量表(EQ-VAS)和國際膝關節評分委員會(IKDC )主觀和客觀評估表進行臨床評分，結果顯示治療2個月、6個月和12個月后臨床各項評分均較術前顯著提高。Everts 等[23] 在單側全膝關節置換手術后應用PRP，隨訪5個月，發現應用PRP后關節纖維化程度較對照組明顯減輕，關節活動范圍明顯好。Mitsuyama 等[24] 研究了PRP對人類軟骨細胞的作用，10 位參與試驗的志愿者分別提供全血和膝關節軟骨組織，用于制作PRP和提取軟骨細胞，將提取出的軟骨細胞分別以不同濃度的PRP處理，觀測其增殖情況。10 天后觀測結果顯示，30% 的PRP能顯著促進人軟骨細胞的增殖，細胞增殖不僅受PRP影響，而且與PRP濃度的增加成正相關。如上所述，PRP可以作為修復軟骨時的一種治療選擇
3.4 修復韌帶/ 肌腱損傷
肌腱組織由腱細胞、纖維膠原蛋白和水分構成，自身缺乏血液供應，故受損后的愈合速度慢于其他結締組織。隨著研究深入，學者們發現生長因子在韌帶修復過程中起到至關重要的作用，進而嘗試利用PRP來促進或輔助治療肌腱損傷。Anitua 等[25]將PRP與人肌腱細胞共培養后發現，隨著肌腱細胞的增殖，培養基中VEGF及肝細胞生長因子(HGF)也相應增加，而VEGF具有促進血管形成的作用，HGF具有抗纖維化作用，減少瘢痕形成。臨床應用PRP治療韌帶/ 肌腱損傷取得滿意療效。Sánchez等[26]收治12例跟腱撕裂患者，其中6 例作為試驗組在手術同時進行PRP 輔助治療，6 例作為對照組只進行手術治療。結果顯示試驗組患者恢復活動范圍較對照組早，且未發生相關并發癥，Mishra等[27]應用超聲引導使用PRP治療慢性肘部肌腱疾病取得滿意療效。140例患者均首先給予理療及其他非手術治療，20例患者疼痛無好轉，其中15 例經皮下注射PRP，對照組5 例注射布比卡因，隨訪皮下注射PRP 患者中，8 周后60% 患者疼痛緩解，6 個月后81% 患者疼痛緩解，25.6 個月后93% 疼痛緩解并且能在更短時間內恢復訓練活動
3.5 預防骨與關節感染
骨與關節感染是骨科手術面臨的難題之一，常用預防方法是在圍手術期應用抗生素[28]。但長期大量應用抗生素不僅帶來各種系統副作用，還會導致耐藥菌株的出現[29]。因此，有必要探索一種新的解決骨感染問題的方法。PRP由于其含有的高濃度血小板可以釋放大量生長因子，當PRP被凝血酶激活后形成血小板-白細胞凝膠(PLG)，其中含有高濃度的血小板和白細胞，這些細胞成分在機體先天免疫防御反應中發揮著趨化、吞噬和氧化殺菌等重要作用[30] 。此外，血小板還可釋放大量生長因子促進被炎癥破壞的組織細胞再生，為炎癥消退提供良好的局部微環境。PRP的這種多重特性使其具有傳統抗生素所不具備的優勢。因此，作為一種“生物抗菌制劑”，PRP為我們預防和治療骨感染提供了一種新的思路。Bielecki 等[31] 通過紙片擴散法研究發現，PLG在體外可以抑制金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的生長。Moojen 等[32] 也報道了PLG在體外具有抑制金黃色葡萄球菌生長的作用。此外，一些臨床研究表明PLG可降低外科手術后的出血和感染發生率[33-34]。PLG在體外不僅可以抑制金黃色葡萄球菌的生長，而且在體內局部應用還可以抑制細菌生長，還可以協同機體免疫防御系統殺滅細菌，從而預防骨與關節感染的發生。
4 展望
采用生物的方法解決生物和醫學問題是目前研究組織修復的熱點。PRP完全是自體的, 無疾病傳染及免疫排斥反應, 從根本上解決了傳播疾病的危險及骨組織工程學一直面臨的移植物難以存活的難題; PRP中含有多種高濃度的生長因子, 各生長因子的比例與體內正常比例相似, 并具有最佳的協同作用, 既有單一因子的生物學效應, 又有各種生長因子之間的相互作用。這在一定程度上彌補了單一生長因子刺激成骨效果不佳的缺點, 滿足了早期骨愈合所需生長因子的需要; PRP有促凝血的作用, 可刺激軟組織再生, 促進傷口早期愈合; PRP中所含的生長因子不進入細胞內或細胞核內,使正常的愈合過程加速, 無致畸作用, 也不具有誘導腫瘤形成的能力; PRP制作簡單且對患者的損傷小, 只需從患者的靜脈取血即可制作PRP, 國外已有專門制作PRP的儀器, 操作簡便并且所需時間短。因此, PRP是一種安全的、簡便的、廉價的可用于骨科的各個治療領域，應用前景廣泛。
但PRP用于臨床尤其是在骨科領域仍有許多尚未解決的問題，如PRP制備無統一標準，不同方法制備的PRP生長因子濃度差異大，PRP所含生長因子數量及其生長因子的相互作用機制仍不明確等。因此對PRP研究首先要建立一套高效穩定、對PLT破壞小、純度高而穩定的PRP制備方法; 其次在應用PRP時盡量避免影響PRP療效的因素; 選擇適當的載體使PRP 與載體結合以提高PRP骨再生能力, 建立動物模型, 設計標準化的試驗, 為PRP的臨床應用提供依據。
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